服务价格 服务编号 价格 周期 CWS083 ￥1898/目的蛋白·膜 2周 服务内容　　通过预实验优化实验条件，摸索一抗稀释度，选择其中最佳的一个稀释度进行正式实验。 样品要求　　客户需新鲜或正确保存的蛋白样品，目的蛋白阳性表达样品（有阳性表达的细胞或组织）， 检测目的蛋白的一抗（或由康为世纪代购）。样品要求为：　　·裂解样品总蛋白量>500ug/样品。　　·细胞样品总蛋白浓度＞1mg/ml。　　·组织样品总蛋白浓度 10-15mg/ml。 终产品　　·曝光结果（胶片和扫描图）；　　·完整实验报告。 服务说明　　·建议提供目的蛋白阳性表达样品（纯蛋白或有阳性表达的细胞或组织）作为阳性对照。　　·每张膜可检测1-8个样品。　　·一抗需在正确条件下保存，避免污染及反复冻融。　　·如需康为世纪进行数据分析，请另询价。 ★Western blot操作流程介绍　　1. 蛋白质抽提　　(1) 组织样品，取适合量的新鲜组织样品或正确保存的组织样品（非常重要），加1ml 含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂或其它蛋白提取试剂，匀浆后抽提总蛋白或核、膜蛋白。　　(2) 细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，用PBS清洗细胞，去PBS加0.1-1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂或其它蛋白提取试剂抽提总蛋白或核、膜蛋白。　　2. 蛋白质定量： BCA蛋白检测试剂检测蛋白的浓度。 　　3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳（SDS-PAGE），用微量加样枪准确加样到相应的加样孔中，安装电泳分离蛋白。　　4. 蛋白转移到硝酸纤维膜或PVDF膜上。按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4℃转移过夜。　　5. 膜的封闭和抗体孵育　　(1) 膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非物异结合。　　(2) 封闭过的膜加入一级抗体室温孵育膜1.5h,抗体抗原结合。　　(3) 加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量 标准，室温孵育膜1小时，加入HRP标记的GAPDH/b-actin抗体可以同时检测 GAPDH/b-actin含量。　　6. 结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X光胶片曝光显影。